Pico488 DNA 定量溶液是一種超靈敏試劑，用于在無法通過測(cè)量 260 nm 吸光度來確定雙鏈 DNA 濃度時(shí)測(cè)量雙鏈 DNA 濃度。 Pico488 選擇性地結(jié)合雙鏈 DNA，因此核苷酸、單鏈 DNA、RNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)不會(huì)妨礙測(cè)量。與雙鏈 DNA 結(jié)合的染料在 503 nm 處最大吸收光并在 525 nm 處最大發(fā)射光。為了檢測(cè)測(cè)定讀數(shù)，可以使用任何類型的熒光計(jì)或熒光板讀數(shù)器。

Pico488 測(cè)量 DNA 濃度的線性范圍為 1 pg/μL — 5 ng/μL。為了實(shí)現(xiàn)精確、可重復(fù)的熒光測(cè)量，我們建議在 TE 緩沖液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA）中稀釋 DNA 和 Pico488。為了計(jì)算 DNA 濃度，我們建議首先使用一系列 DNA 標(biāo)準(zhǔn)稀釋液建立校準(zhǔn)曲線。

Lumprobe 銷售各種包裝的Pico488 DNA 定量溶液和Pico488 DNA 定量試劑盒。除了 Pico488 溶液之外，該試劑盒還包括緩沖液和 DNA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。如果測(cè)定體積等于 2 ml，則試劑盒提供的染料溶液量足以分析標(biāo)準(zhǔn)熒光比色皿（體積 3.5 ml）中的 200 個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)。如果使用其他類型的設(shè)備來檢測(cè)熒光，則可以重新調(diào)整測(cè)定范圍。下表提供了常用熒光設(shè)備的推薦檢測(cè)體積。

協(xié)議

1. Pico488工作液的制備

解凍 Pico488 染料瓶中的內(nèi)容物，充分混合，并用緩沖液將所需量的 Pico488 染料溶液稀釋 200 倍（我們建議使用 10 mM Тris HCl、1 mM EDTA，pH 7.5）。混合并在3小時(shí)內(nèi)使用。每個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)的 Pico488 工作溶液體積應(yīng)等于測(cè)定體積的 50%（查看下表以查找適合您的熒光測(cè)定設(shè)備類型的推薦體積）。為所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)（針對(duì)您計(jì)劃分析的所有樣品和所有 DNA 標(biāo)準(zhǔn)稀釋液）準(zhǔn)備足夠的 Pico488 工作溶液。還包括額外 10-25% 的 Pico488 工作溶液體積，以排除可能的移液錯(cuò)誤。要計(jì)算稀釋后的 Pico448 的體積，可以使用以下公式：

V Pico488 = 5/8 × V測(cè)定× (N 個(gè)樣品+ N 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品)， 其中 V測(cè)定是樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定體積，mL，N 個(gè)樣品 是您計(jì)劃分析的樣品數(shù)量，N 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品是您計(jì)劃分析的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量（包括空白樣品）。

2. 樣品溶液的制備

在緩沖液中稀釋 DNA 樣本，使溶液體積等于測(cè)定體積的 50%（您可以使用任意量的 DNA）。添加等體積的 Pico488 工作溶液。混合并孵育 5 分鐘。同樣，制備 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液。請(qǐng)注意，DNA 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度應(yīng)在樣品中 DNA 濃度的范圍內(nèi)。 DNA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液僅隨Pico488 DNA 定量試劑盒提供。Pico488 DNA 定量解決方案的用戶 應(yīng)使用自己的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品。

使用Pico488 DNA 定量溶液進(jìn)行 DNA 定量的推薦體積：

* 為了保持測(cè)量的準(zhǔn)確性和精密度，我們建議避免移液量低于 2 µL。

3. 熒光測(cè)量

使用適當(dāng)?shù)奈蘸桶l(fā)射波長或?yàn)V光片測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)和樣品 DNA 溶液的熒光（雙鏈 DNA 結(jié)合的 Pico488 染料吸收最大波長為 503 nm 的光，發(fā)射最大波長為 525 nm 的光）。

4. DNA濃度的計(jì)算

繪制熒光與 濃度的關(guān)系圖，并在任何軟件中應(yīng)用線性回歸函數(shù)，以獲得反映熒光 ( FL ) 與濃度 ( C ) 依賴性的線性方程：
FL = A × C + B。

要計(jì)算稀釋樣品中的 DNA 濃度，請(qǐng)使用以下公式：
C樣品= (FL樣品 — B)/A，其中FL樣品是樣品溶液熒光。

要計(jì)算未稀釋樣品中的 DNA 濃度，請(qǐng)使用以下公式：
С init = V Assay × C Sample  / V init，其中 V Assay是測(cè)定體積（mL），V init是初始 DNA 樣品的體積（μL）

或者，您可以使用我們的dsDNA 定量和稀釋 計(jì)算器完成所有必要的計(jì)算。

線性回歸示例：熒光與 DNA 濃度