常見細胞污染

細胞污染——培養物出現渾濁、混濁。培養液pH值升高，液黃。細胞異常的形態，如胞質內細菌吞噬體。細胞的生長速率減緩，對數生長期變得不規律。異常的細胞死亡或細胞溶解情況。

真菌污染——培養液可能出現異味。培養皿內有異常的顏色、紋理或斑點。細胞顯示出不正常的細胞形態，如真菌吞噬體或真菌絲狀體。細胞的生長速率可能受到抑制，細胞數量不斷減少。

支原體污染——支原體污染通常不會導致明顯的細胞培養液變化。因此，支原體污染通常需要PCR或DNA雜交來檢測。可能出現感染跡象，如出現包涵體或囊泡。細胞的生長速率減緩。

常見污染處理

因污染會改變細胞表型，在細胞種子充足及排除污染因素的情況下，首先丟棄污染細胞，重新復蘇。

在未檢測的情況下沿用當前細胞試劑及耗材可能導致污染擴散，應及時滅菌或丟棄。

如果懷疑細胞培養受到污染，應立即采取行動來確認并解決問題。常見的處理方法包括：

1.隔離：將受污染的培養物隔離，并最后處理污染細胞，以防止污染蔓延到其他培養物中。

2.污染源排除：查找和消除污染的來源，可使用無抗LB搖菌培養或污染檢測試劑。

3.更換培養液：將受污染的培養液更換為新的培養液，細菌污染添加敏感抗生素如氨芐青霉素，真菌添加兩性霉素B，支原體添加氧氟沙星以控制污染。

4.細胞重新傳代：如有必要，將細胞重新傳代到新的培養皿中，離心速度低于平時，200-300g。

5.污染檢測：進行污染檢測，以確認污染的類型和程度，從而采取適當的措施。

操作手冊

● 原代細胞提取

● 血清更換注意事項及步驟

● 血清儲存及化凍

● 持續更新中

原代細胞提取-1

固體組織樣品（肝，肺，腫瘤等）

1.分離組織后立即移入超凈臺操作（＜20min)，或放入組織保存液中四度保存（不超過48h)。

注意：以下步驟均需無菌操作，且保持低溫！

2.取一無菌小皿，加入3ml預冷的PBS，放入組織清洗。重復此步驟一次。

3.用無菌剪和無菌鑷（高溫高壓滅菌）去除脂肪或壞死區域等非目標組織。

4.轉移組織塊至一無菌15ml/50ml離心管中，加入組織體積10倍的advanced DMEM/F12培養基（緩沖液可自行調整，與后續培養體系一致）。離心管置于冰上，用無菌剪將組織剪成肉泥狀。（此步驟注意低溫）

5.四度600g離心5分鐘，去上清，加入消化液（浸沒組織），37℃搖床（800rpm)消化15min，視解離狀態調整消化時間，一般不超過45min。（消化液需視組織類型自行調整。一般組成為膠原酶1和4，濃度為400-1000U/ml，以及核酸酶5-20U/ml，可選擇添加10uM ROCK抑制劑以提高組織活率。）

原代細胞提取-2

6.消化結束立即冰上，加入體積6%的血清終止消化，四度離心棄上清，用巴氏管吸取1-2ml全培養基重懸后細胞濾網過濾，根據后續目的和細胞類型選擇濾網大小（類器官需要細胞團一般選擇較大的100um，建庫的單細胞懸液一般選擇70um或更小）。

7.視上一步沉淀顏色選擇是否裂紅，裂紅至沉淀無明顯紅色即可。裂紅液現配，至少10ml，常溫避光裂紅10min。

8.用巴氏管充分混勻細胞懸液，吸取10ul細胞懸液與2x臺盼藍混勻后計數板計數。一般細胞活性＞85%為達標。如不達標，則低速(200-300g)四度離心后棄上清，重懸，再次計數和測量活性，直至達標。）

9.計算所需細胞數量并進行下一步操作，直接種板培養，點膠，或上機等。

液體樣品（血液，胸水，腹水等）

1.直接600g四度離心5min后棄上清，用medium重懸清洗兩次。

2.過濾可選，直接進入裂紅判斷步驟

3.后續步驟同上。