多肽是由多個氨基酸通過肽鍵連接而成的化合物。它們在生物體中普遍存在。迄今為止，已在生物體中發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種多肽。多肽在生命活動中對各系統(tǒng)、器官、組織、細胞的功能活動發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。常用于功能分析、抗體研究、藥物開發(fā)等領(lǐng)域。隨著生物技術(shù)和多肽合成技術(shù)的成熟，越來越多的多肽藥物被開發(fā)并應(yīng)用于臨床。

多肽修飾有很多種，簡單分為后修飾和過程修飾（利用衍生氨基酸）。根據(jù)修飾位點的不同，有N端修飾、C端修飾、側(cè)鏈修飾、氨基酸修飾、骨架修飾等。作為改變肽鏈主鏈結(jié)構(gòu)或側(cè)鏈基團的重要手段、肽修飾可以有效改變肽化合物的理化性質(zhì)，增加水溶性，延長在體內(nèi)的作用時間，改變其生物分布，消除免疫原性，減少毒副作用等。這里主要介紹幾種主要的肽修飾策略和特點。

1.環(huán)化

環(huán)肽在生物醫(yī)學(xué)方面有很多應(yīng)用，許多具有生物活性的天然肽都是環(huán)肽。由于環(huán)肽比線性肽剛性更強，因此對消化系統(tǒng)具有很強的抵抗力，能在消化道中存活，并且與目標受體有更強的親和力。環(huán)化是合成環(huán)狀多肽最直接的方法，特別是對于結(jié)構(gòu)骨架較大的多肽。按環(huán)化方式可分為側(cè)鏈-側(cè)鏈型、末端-側(cè)鏈型、末端-末端型。

(1) 側(cè)鏈到側(cè)鏈

最常見的側(cè)鏈-側(cè)鏈環(huán)化類型是半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。最常見的側(cè)鏈-側(cè)鏈環(huán)化類型是半胱氨酸殘基之間的二硫鍵橋接。引入環(huán)化方法是通過將一對半胱氨酸殘基脫保護，然后氧化形成二硫鍵。它可以選擇性地除去巰基保護基團，從而實現(xiàn)形成多個環(huán)。環(huán)化可以在解離后在溶劑中進行，也可以在解離前在樹脂上進行。由于樹脂上的肽不易形成環(huán)化構(gòu)象，因此樹脂上的環(huán)化可能比溶劑中的環(huán)化效率低。

另一種類型的側(cè)鏈-側(cè)鏈環(huán)化是在天冬氨酸或谷氨酸殘基與堿性氨基酸之間形成酰胺結(jié)構(gòu)。它要求多肽的側(cè)鏈保護無論是在樹脂上還是解離后的堿基都必須能夠選擇性去除。第三種側(cè)鏈-側(cè)鏈環(huán)化是通過酪氨酸或?qū)αu基苯基甘氨酸形成二苯醚。天然產(chǎn)物中的這種環(huán)化僅存在于微生物產(chǎn)物中，環(huán)化產(chǎn)物往往具有潛在的藥用價值。這些化合物的制備需要的反應(yīng)條件，因此它們不常用于常規(guī)多肽的合成。

(2) 終端到側(cè)鏈

末端側(cè)鏈環(huán)化通常涉及C末端和賴氨酸或鳥氨酸側(cè)鏈的氨基，或者N末端和天冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈。還有一些多肽環(huán)化是通過末端C與絲氨酸或蘇氨酸側(cè)鏈之間形成醚鍵來實現(xiàn)的。

(3)端對端或頭對尾

鏈狀多肽可以在溶劑中環(huán)化或通過側(cè)鏈環(huán)化固定在樹脂上。在溶劑中環(huán)化應(yīng)使用低濃度的多肽以避免多肽的寡聚化。頭尾相連合成的環(huán)肽的產(chǎn)量取決于鏈肽的序列。因此，在大規(guī)模制備環(huán)肽之前，應(yīng)首先創(chuàng)建可能的鏈狀先導(dǎo)肽文庫，然后進行環(huán)化，尋找能夠達到最佳結(jié)果的序列。

2.N-甲基化

N-甲基化首先出現(xiàn)在天然肽中，并被引入肽合成中以阻止氫鍵的形成，從而使肽更能抵抗生物降解和清除。利用N-甲基化氨基酸衍生物合成肽是最重要的方法。此外，N-(2-硝基苯磺酰氯)肽-樹脂中間體也可用于與甲醇的Mitsunobu反應(yīng)。該方法已用于制備含有N-甲基化氨基酸的環(huán)肽文庫。

3.磷酸化

磷酸化是自然界最常見的翻譯后修飾之一。在人體細胞中，超過30%的蛋白質(zhì)被磷酸化。磷酸化，特別是可逆磷酸化，在許多細胞過程的控制中發(fā)揮著重要作用，例如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達、細胞周期和細胞骨架調(diào)節(jié)以及細胞凋亡。

可以在各種氨基酸殘基上觀察到磷酸化，但最常見的磷酸化目標是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基。磷酸酪氨酸、磷酸蘇氨酸和磷酸絲氨酸衍生物可以在合成期間引入到多肽中或者可以在多肽合成之后形成。選擇性磷酸化可以通過使用可以選擇性去除保護基的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基來實現(xiàn)。一些磷酸化試劑也可以進行后修飾以將磷酸基團引入多肽中。近年來，有學(xué)者利用化學(xué)選擇性施陶丁格-亞磷酸酯反應(yīng)實現(xiàn)賴氨酸的位點特異性磷酸化。

4.肉豆蔻酰化和棕櫚酰化

N 末端被脂肪酸酰化使得肽或蛋白質(zhì)能夠與細胞膜結(jié)合。 N端的肉豆蔻酰化序列可以靶向Src家族的蛋白激酶和逆轉(zhuǎn)錄酶Gaq蛋白，從而與細胞膜結(jié)合。可以使用標準偶聯(lián)反應(yīng)將肉豆蔻酸連接到樹脂-多肽的N末端，并且可以在標準條件下解離所得脂肽并通過RP-HPLC純化。

5.糖基化

萬古霉素和替考拉寧等糖肽是治療耐藥細菌感染的重要抗生素，其他糖肽也常用于刺激免疫系統(tǒng)。此外，由于許多微生物抗原都被糖基化，因此糖肽的研究對于提高感染的治療效果具有重要意義。另一方面，一些研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞細胞膜上的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出異常的糖基化，這使得糖肽在癌癥和腫瘤免疫防御研究中也發(fā)揮著重要作用。糖肽的制備一般采用Fmoc/t-Bu法。糖基化殘基，如蘇氨酸和絲氨酸，通常通過五氟苯酚酯活化的 Fmoc 保護的糖基化氨基酸引入多肽中。

6.異戊二烯化

異戊二烯化發(fā)生在靠近C末端的側(cè)鏈上的半胱氨酸殘基處。蛋白質(zhì)的異戊二烯化可以增加細胞膜的親和力，形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。異戊烯化蛋白包括酪氨酸磷酸酶、小 GTP 酶、共伴侶分子、核纖層和著絲粒結(jié)合蛋白。異戊二烯化的多肽可以通過在樹脂上異戊二烯化或通過引入半胱氨酸衍生物來制備。

7.聚乙二醇（PEG）改性

PEG 修飾可用于改善蛋白水解穩(wěn)定性、生物分布和肽溶解度。在多肽上引入PEG鏈可以改善其藥理性質(zhì)，還可以抑制蛋白水解酶對多肽的水解。 PEG多肽比普通多肽更容易通過腎小球毛細血管橫截面，大大降低腎臟清除率。

由于PEG多肽在體內(nèi)的有效半衰期延長，因此可以通過使用較低劑量和較低頻率的多肽藥物來維持正常的治療水平。但PEG修飾也有負面影響。大量的PEG會阻止酶降解多肽，但也會減少多肽與靶受體的結(jié)合。然而，PEG多肽的低親和力通常被其較長的藥代動力學(xué)半衰期所抵消。通過在體內(nèi)停留更長時間，PEG 多肽更有可能被靶組織吸收。因此，應(yīng)優(yōu)化 PEG 聚合物的規(guī)格以獲得最佳結(jié)果。另一方面，由于腎臟清除率降低，PEG多肽可在肝臟中積聚并引起大分子綜合征。所以，當肽用于藥物測試時，需要更仔細地設(shè)計 PEG 修飾。

PEG修飾劑常見的修飾基團可概括如下：氨基（-Amine）-NH2、氨甲基-CH2-NH2、羥基-OH、羧基-COOH、硫氫基（-Thiol）-SH、馬來酰亞胺-MAL、琥珀酰亞胺碳酸酯- SC、琥珀酰亞胺乙酸酯-SCM、琥珀酰亞胺丙酸酯-SPA、N-羥基琥珀酰亞胺-NHS、丙酸基-CH2CH2COOH、醛基-CHO(如丙醛-ALD、丁醛-butyrALD)、丙烯酸(-Acrylate)-ACRL、疊氮基-疊氮化物、生物素-生物素、熒光素-熒光素、戊二酸-GA、酰肼-酰肼、炔基-炔、對甲苯磺酸鹽-OTs、琥珀酰亞胺基琥珀酸鹽-SS等。帶有羧酸的PEG衍生物可以與N-偶聯(lián)。末端胺或賴氨酸側(cè)鏈。氨基活化的 PEG 可以與天冬氨酸或谷氨酸側(cè)鏈偶聯(lián)。MAL激活的PEG可以與全脫保護的半胱氨酸側(cè)鏈的硫醇偶聯(lián)[11]。 PEG修飾劑的常見分類如下（注：mPEG為甲氧基-PEG、CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH）：

(1)線性PEG修飾劑

mPEG-SC、mPEG-SCM、mPEG-SPA、mPEG-OTs、mPEG-SH、mPEG-ALD、mPEG-丁醇 ALD、mPEG-SS

(2)雙功能PEG修飾劑

HCOO-PEG-COOH、NH2-PEG-NH2、OH-PEG-COOH、OH-PEG-NH2、HCl·NH2-PEG-COOH、MAL-PEG-NHS

( 3)支鏈PEG修飾劑

(mPEG)2-NHS、(mPEG)2-ALD、(mPEG)2-NH2、(mPEG)2-MA7

8.生物素化

生物素可以與親和素或鏈霉親和素強烈結(jié)合，結(jié)合強度甚至接近共價鍵。生物素標記的肽通常用于免疫測定、組織細胞化學(xué)和基于熒光的流式細胞術(shù)。標記的抗生物素抗體也可用于結(jié)合生物素化的多肽。生物素標簽通常附著在賴氨酸的側(cè)鏈或 N 末端。通常使用 6-氨基己酸作為肽和生物素之間的連接物。該鏈接可以靈活地與基底結(jié)合，并且在空間位阻下可以更好地結(jié)合。

9.熒光標記

熒光標記可用于追蹤活細胞中的肽，以及研究酶和作用機制。色氨酸 (Trp) 具有熒光性，因此可用于內(nèi)部標記。色氨酸的發(fā)射光譜取決于周圍環(huán)境，并隨著溶劑極性的降低而降低。該特性對于檢測肽結(jié)構(gòu)和受體結(jié)合非常有用。色氨酸熒光可以被質(zhì)子化的天冬氨酸和谷氨酸猝滅，這可能限制其使用。丹磺酰氯基團（Dansyl）與氨基結(jié)合時具有高熒光性，也常用于氨基酸或蛋白質(zhì)的熒光標記。

熒光共振能量轉(zhuǎn)換（FRET）對于酶研究非常有用。當使用FRET時，底物肽通常含有熒光標記基團和熒光猝滅基團。標記的熒光團將通過非光子能量轉(zhuǎn)移被猝滅劑猝滅。當肽與所研究的酶解離時，標記基團會發(fā)出熒光。

10.包層肽

籠形多肽具有光學(xué)可去除的保護基團，可以屏蔽多肽與受體的結(jié)合。當受到紫外線照射時，肽將被激活，恢復(fù)其與受體的親和力。由于這種光學(xué)激活可以根據(jù)時間、幅度或位置進行控制，因此包合物多肽可用于研究細胞中發(fā)生的反應(yīng)。籠形多肽常用的保護基是2-硝基芐基及其衍生物，可以在多肽合成過程中通過受保護的氨基酸衍生物引入。已開發(fā)的氨基酸衍生物包括賴氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和酪氨酸。然而，天冬氨酸和谷氨酸衍生物并不常用，因為它們在肽合成和解離過程中容易環(huán)化。

11.多聚體抗原肽（MAP）

短肽通常不具有免疫性，必須與載體蛋白偶聯(lián)才能產(chǎn)生抗體。多聚抗原肽（MAP）由多個相同的多肽連接到賴氨酸核心上組成，可以特異性表達高效免疫原，可用于制備肽-載體蛋白偶聯(lián)物。 MAP多肽可以通過在MAP樹脂上固相合成來逐步合成。然而，不全的偶聯(lián)會導(dǎo)致某些分支上的肽鏈缺失或截斷，從而無法顯示原始MAP多肽的特性。作為替代方法，可以單獨制備和純化多肽，然后將其偶聯(lián)至MAP。連接到肽核心的肽序列清晰，可以通過質(zhì)譜輕松表征。

結(jié)論

肽修飾是設(shè)計肽的重要方法。化學(xué)修飾的肽不僅可以保持較高的生物活性，而且可以有效避免免疫原性和毒性的缺點。同時，化學(xué)修飾可以賦予肽一些新的優(yōu)異性能。 。近年來，利用CH活化的方式對肽進行后期修飾的方法也得到迅速發(fā)展，并取得了許多重要成果。